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Laboratorio de Microbiología

 En el laboratorio de Microbiología se realizan análisis que permiten determinar la inocuidad de muestras de alimentos para animales y materias primas; así como evaluar la higiene en su procesamiento, contaminantes y en general, la calidad del alimento. Como parte de este proceso de realizan cuantificaciones de microorganismos indicadores, detección de Salmonella spp. y de compuestos de interés en alimentos, como lo son las micotoxinas y antibióticos.

Como parte del desarrollo de las actividades del laboratorio, se lleva control de los lotes de medios de cultivo, diluyentes, mecanismos de esterilización, control ambiental y de equipos, con la finalidad de garantizar la calidad en el servicio brindado. Para la detección de microorganismos se trabaja con técnica aséptica.

A continuación, se describen los análisis microbiológicos realizados en el CINA.

 

Determinación de Coliformes totales y Escherichia coli por la técnica de Número Más Probable (NMP)

El grupo bacteriano llamado coliformes no tiene relación taxonómica ni genética. Se definen como bacilos Gram negativos, no productores de esporas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 35-37 ºC. Incluye géneros como Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter y Escherichia.

La determinación de Coliformes totales y E. coli en muestras de alimentos se utilizan como indicadores de inocuidad y de las condiciones higiénicas del proceso de elaboración del producto. Adicionalmente, E. coli ha sido empleado como indicador de presencia de patógenos, no obstante, debido a su ubicuidad no necesariamente en su ausencia se descarta la ausencia del patógeno, y su presencia tampoco indica que inequívocamente el patógeno está presente.

La técnica de NMP es una técnica estadística e indirecta, que se aplica a muestras con bajo número de microorganismos o que puedan contener bacterias que han sido afectadas por el proceso de producción. En este método, se preparan diluciones seriadas de la muestra y alícuotas de estas se colocan en series de tubos de medio de cultivo. Las alícuotas pueden contener o no microorganismos. El número de tubos con crecimiento positivo se compara con tablas que dan un número estimado de microorganismos en la muestra con un cierto intervalo de confianza que generalmente es de 95%.

El método utilizado está basado en la actividad de la enzima b-glucoronidasa de bacterias incluidas dentro de las coliformes. Su presencia se revela mediante fluorescencia a longitud de onda de 365 nm. La presencia de E. coli se revela mediante la prueba de indol, para la cual el 95% de las cepas de esta especie son positivas.

Es importante recalcar, que la presencia de enzimas nativas en el músculo de productos derivados de pescado, mariscos o crustáceos interfiere con el resultado.

 

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Recuento total aerobio mesófilo

Este análisis ha sido empleado a través de los años para determinar evaluar las condiciones y adherencia a buenas prácticas de manufactura en su procesamiento, como un indicador de la calidad del producto y no se recomienda emplear el resultado de esta determinación como indicador de la presencia de patógenos. El recuento total aerobio mesófilo también es útil para determinar la calidad bacteriológica no sólo del alimento, sino también de materias primas que se emplean en la preparación del alimento.

El recuento total aerobio mesófilo consiste en proveer las condiciones apropiadas para que, si la muestra presenta bacterias que crecen típicamente en condiciones aeróbicas y, a temperaturas entre (20-45) °C, estas puedan ser cuantificadas. En el análisis se preparan diluciones de la muestra y se inoculan en un medio de cultivo que posee las características nutricionales apropiadas para el crecimiento de bacterias mesófilas y aerobias. Finalmente se seleccionan los platos con crecimiento adecuado para realizar el conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de las bacterias descritas.

Recuento de hongos y levaduras

El reino Fungi incluye tanto hongos levaduriformes como mohos. Estos organismos pueden típicamente desarrollarse en amplios rangos de pH, a temperaturas entre (5-35)°C y en condiciones aerobias. Pueden además contribuir con el deterioro de los alimentos y ciertas especies bajo condiciones específicas, son capaces además de producir toxinas.

En el método del laboratorio se analizan diluciones de la muestra que se inoculan sobre placas con un medio de cultivo especial para el desarrollo de hongos y levaduras y la inhibición de bacterias. Posteriormente a su incubación se escogencias las placas que permiten el adecuado recuento de los hongos y levaduras aislados del alimento.

 

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Determinación de Salmonella spp.

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es género está constituido por bacilos Gram negativos, no productores de esporas, en su mayoría móviles por presencia de flagelos, anaerobios facultativos con capacidad de adaptarse a condiciones ambientales.

El género Salmonella está constituido por dos especies: S. enterica y S. bongori. S. enterica (especie tipo) a su vez está compuesta por 6 subespecies:

      • S. enterica subespecie enterica
      • S. enterica  subespecie salamae
      • S. enterica  subespecie arizonae
      • S. enterica  subespecie diarizonae
      • S. enterica  subespecie houtenae
      • S. enterica  subespecie indica

Las especies de S. enterica y S. bongori se incluyen más de 2500 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la especie S. enterica.

Alimentos para animales contaminados con Salmonella spp. han sido considerados la principal fuente de infecciones por salmonelosis en seres humanos. Cabe aclarar que, también los animales se pueden ver afectados, en algunos casos pueden ser asintomáticos y funcionar como reservorio de la bacteria y a su vez servir como fuente de transmisión.

En el método empleado en el laboratorio se sigue una serie de pasos para realizar el apropiado aislamiento de esta bacteria. Por tanto, se sigue una marcha analítica que incluye fase de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento selectivo, pruebas bioquímicas y serológicas y confirmación.

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Micotoxinas y Antibióticos

Tanto el análisis de micotoxinas, como el análisis de antibióticos se realizan en conjunto con el Laboratorio de Química. La extracción y limpieza de la  muestra se llevan a cabo en el Laboratorio de Microbiología. En el Laboratorio de Química mediante cromatografía líquida de alta precisión acoplado a un espectrofotómetro de masas se separan por afinidad diferencial las moléculas de interés, se identifican y se cuantifican.

Las micotoxinas son compuestos que sintetizan los hongos como metabolitos secundarios, en otras palabras, no son necesarios para su crecimiento, reproducción y sobrevivencia como lo son los metabolitos primarios. Su producción está relacionada con el proceso de esporulación del hongo, condiciones ambientales (temperatura, disponibilidad de agua, gases atmosféricos) y nutrientes y preservantes disponibles. En el Laboratorio de Química del CINA se detectan y cuantifican las siguientes micotoxinas:

      •  AFB1 (Aflatoxina B1)
      •  AFB2 (Aflatoxina B2)
      •  AFG1 (Aflatoxina G1)
      • AFG2 (Aflatoxina G2)
      • Tricoteceno T-2
      • FB1 (Fumonisina B1)
      • FB2 (Fumonisina B2)
      • ZEA (Zearalenona)
      • alfa-ZOL (alfa-zearalenol)
      • beta-ZOL (beta-zearalenol)
      • OTA (Ocratoxina A)
      • OTB (Ocratoxina B)

 

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Las micotoxinas se han encontrado en alimentos para animales terminados y en sus ingredientes como maíz y trigo. Pueden estar presentes, aunque no se detecten hongos toxigénicos y viceversa, puede que el hongo esté presente y no así la toxina. Adicionalmente, las micotoxinas se pueden generar en distintas fases de la producción del alimento; desde la cosecha hasta el almacenamiento.

Los efectos que estas moléculas pueden desencadenar intoxicaciones aguas o crónicas. La gama de efectos que estas sustancias pueden llegar a provocar en los animales es amplia, desde que sea nulo, afecte el sistema digestivo hasta que se consideren como hepatotóxicos, carcinogénicos, mutagénicos, teratogénicos, inmunosupresores, e inclusive letales. La susceptibilidad a cada micotoxina depende del animal, concentración y exposición.

Los antibióticos son agregados a los alimentos animales como promotores de crecimiento y como profilaxis para prevenir el desarrollo de infecciones, su uso es actualmente discutido por preocupación en la temática de resistencia a antibióticos. En el Laboratorio de Química del CINA se detectan y cuantifican los siguientes antibióticos:

      • Sulfametazina
      • Oxitetraciclina
      • Clortetraciclina
      • Tetraciclina
      • Florfenicol
      • Cloranfenicol
      • Lincomicina
      • Virginiamicina M1
      • Monensina A
      • Narasina
      • Virginiamicina
      • Tilosina

Muestras para análisis microbiológicos

      • Productos terminados.
      • Materias primas de alimentos.

Se recomienda consultar alcance del laboratorio antes de traer la muestra.

Requisitos:

      • Las muestras para determinaciones de microorganismos y antibióticos deben tener un peso mínimo de 500 g.
      • Las muestras de micotoxinas deben contener 5 kg y estar compuesta por submuestras del lote.

Recomendaciones:

      • Identifique inequívocamente la muestra. Anote el solicitante, tipo de producto, hora y fecha de la recolección, matriz y toda la información sobre el lote; entre otros.
      • Las muestras para análisis microbiológicos se deben trasladarse lo antes posible al laboratorio y en recipientes limpios. Se recomienda que sean entregadas en 24 horas máximo. Además, se debe mantener la muestra a la temperatura en que se encuentra inicialmente, temperatura ambiente para muestras no perecederas, en frío para muestras perecederas y en la medida de lo posible congeladas las que así se encuentran a la hora de muestrear. En los dos últimos casos, se aconseja que si se emplea hielo no entre en contacto directo con la muestra. Estas recomendaciones se realizan con la finalidad de que el tiempo transcurrido, la microbiota acompañante de los microorganismos de interés y la temperatura de transporte afecten lo mínimo posible los análisis correspondientes.

 

 

 



 

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