Laboratorio de Microbiología

 

En el laboratorio de Microbiología se realizan análisis que ayudan a garantizar la inocuidad de los alimentos para animales y las materias primas; así como para evaluar la higiene en el proceso de preparación.

1.1. Análisis microbiológicos

La técnica de NMP es una técnica estadística e indirecta, que se aplica a muestras con bajo número de microorganismos (<10 UFC/g) o con bacterias dañadas.

La muestra, en principio, es diluida y luego alícuotas de las diluciones se colocan en series de tubos de medio de cultivo. Las alícuotas pueden contener o no microorganismos. Se asume que los microorganismos están distribuidos en la muestra de forma aleatoria y que el crecimiento en los tubos ocurrirá con la presencia de uno o más microorganismos. El número de tubos con crecimiento positivo se compara con tablas que dan un número estimado de microorganismos en la muestra con un cierto intervalo de confianza que generalmente es de 95%.

La determinación de Coliformes totales y Escherichia coli en muestras de alimentos se utilizan como indicadores de inocuidad y de las condiciones higiénicas presentes durante el proceso de elaboración del producto. El grupo llamado coliformes no tiene relación taxonómica ni genética. Se definen como bacilos Gram negativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 48 horas a 35 ºC.

1.1.1. Determinación de Escherichia coli

Según las regulaciones existentes para cada producto, es permitida cierta cantidad en materias primas que vayan a ser procesadas con calor u otro procedimiento que baje la cantidad de bacterias, y generalmente no está permitida en alimentos que ya hayan sido procesados.El método utilizado está basado en la actividad de la enzima b-glucoronidasa y la producción de indol.

1.1.1.1. Causas de posibles falsos negativos

La presencia de células muy dañadas puede hacer que no se recuperen durante el ensayo.

La presencia de cepas atípicas de Escherichia coli que no poseen actividad b-glucoronidasa o que tienen una actividad lenta de la misma.

Puede haber represión de la expresión del gen de la enzima b-glucoronidasa inducido por presencia de lactosa en el medio o en la muestra (represión por catabolito) dando como consecuencia resultados negativos.

Altas cantidades de carbohidratos en el medio o en la muestra pueden afectar la producción de Indol. El 95% de las cepas de Escherichia coli aisladas de alimentos es Indol positiva

1.1.1.2. Causas de posibles falsos positivos

La presencia de enzimas nativas en el músculo cuando se procesan productos derivados de pescado, mariscos o crustáceos puede hacer que la muestra tenga fluorescencia

Presencia de la enzima cuando se procesan productos crudos que contengan hígado, ya que el hígado tiene actividad glucoronidasa.

Presencia de otras bacterias diferentes a Escherichia coli que posean la actividad beta glucoronidasa.

Bacterias como Klebsiella sp, Citrobacter diversus y Providencia sp pueden dar la prueba de indol positiva.

1.1.2. Determinación de Coliformes totales

Éste análisis se realiza como control de la higiene de procesos. Cuando aparecen en cantidades importantes, se interpreta que el producto no ha sido correctamente manipulado y por tanto el riesgo de contaminación con otros microorganismos potencialmente patógenos es alta. En el CINA se realiza con la técnica de número más probable.

1.1.3. Recuentos totales

En el caso de las bacterias el recuento que se hace es el recuento total aeróbico mesófilo, que cuenta las bacterias que son capaces de crecer a 37 ºC (temperatura media), en condiciones de presencia de oxígeno normal en el aire. En el caso de recuento de hongos, este se realiza en medios de cultivo que inhiben el crecimiento bacteriano y son incubados durante cinco días; ya que los hongos crecen mucho más despacio que las bacterias.

1.1.4. Determinación de presencia ausencia de Salmonella sp

El género Salmonella está constituido por dos especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori.

Salmonella enterica está compuesta por 6 subespecies:

  • Salmonella enterica subespecie enterica
  • Salmonella enterica subespecie salamae
  • Salmonella enterica subespecie arizonae
  • Salmonella enterica subespcie diarizonae
  • Salmonella enterica subespespecie houtenae
  • Salmonella enterica subespecie indica

 

A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez.

Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp.houtenae 50:b : -)

Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann-White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de Salmonella”, del Instituto Pasteur de París

Salmonella Typhi y Salmonella paratyfi son restringidas al ser humano en su epidemiología, y altamente adaptadas en su patogénesis. Las Salmonella sp no tifoideas tienen un amplio espectro de hospederos vertebrados y epidemiológicamente a menudo involucran alimento para animales.

Los microorganismos

1.1.5. Notas para el muestreo de análisis microbiológicos

La muestra para análisis microbiológicos deben trasladarse lo antes posible , antes de 24 horas al laboratorio para ser analizado en las 12 horas siguientes, después de ese tiempo puede que el microorganismo de interés haya sido suplantado por la flora normal y sea indetectable. En el caso de los recuentos totales entra más tiempo pase el resultado varía más. Las muestras que se quieran analizar por micotoxinas deben tomarse separadamente de las que se toman para determinaciones microbiológicas. Puede tomar primero las de bacterias y usar el mismo chuzo para las de micotoxinas, no es necesario en éste caso que esté estéril. Sin embargo, no utilice material que usó en otra muestra por que puede contaminar con micotoxinas la muestra de interés.

Para alimentos líquidos o semilíquidos (de alto AW como por ejemplo leche) deben mantenerse a aproximadamente 4 ºC hasta su ingreso al laboratorio. Se puede utilizar una hielera. Utilice bolsas gruesas estériles para las diferentes muestras.

1.1.5.1. Procedimiento
  1. Lávese bien las manos con agua y jabón. Puede utilizar alcohol en gel para desinfectarse las manos antes y después de tomar la muestra posterior al lavado. De ser preferible utilice guantes estériles al tomar la muestra.

  2. La muestra se toma con instrumentos estériles, chuzos, paletas, cucharas etc. Se debe depositar la misma en bolsas o recipientes estériles.

  3. Limpie con toallas de papel humedecidas con alcohol de 70 º la superficir del saco, bolsa, o recipiente antes de introducir los chuzos o paletas. Utilice un chuzo diferente para cada muestra.

  4. Tome el chuzo o instrumento estéril y con cuidado retire el papel o plástico que lo rodea. Manipúlelo de la parte que no va a estar en contacto con la muestra. Una vez que retire el papel o plástico cobertor no toque ninguna superficie. Si esto suceda, utilice otro chuzo.

  5. Si no tiene chuzos disponibles, puede lavarlo muy bien con agua y jabón hasta quitar todos los residuos de materia orgánica, luego rocíelo con alcohol de 70º y paselo por un mechero portátil hasta que se queme el alcohol. (tenga mucho cuidado de que sus manos o ropas no estén impregnados de alcohol mientras flamea, utilice un material aislante para sostener el chuzo) . El procedimiento anterior se puede hacer en caso de extrema urgencia, pero no es recomendable como rutina ya que aumenta la posibilidad de que exista contaminación cruzada de las muestras. Si tuvo que realizarlo anótelo en la información de la muestra que se da al laboratorio.

  6. Una vez que tenga la muestra cierre muy bien las bolsas, de ser preferible séllelas (si es material que está caliente, debe doblar la bolsa, pero esperar antes de cerrar para que el vapor caliente no debilite la bolsa y ésta se rompa ésta durante su transporte.

  7. La muestra debe ser significativa de cada lote.

  8. Una vez tomada, identifique inequívocamente la muestra. Anote el solicitante, tipo de producto, hora y fecha de la recolección, matriz y toda la información sobre el lote; entre otros.

  9. Transporte las muestras en cajas, o incluso en recipientes limpios, separadamente del resto de materiales. Si utiliza hieleras, lávelas bien con agua y jabón antes de colocar las muestras.

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1.2. Micotoxinas

Las micotoxinas son toxinas producidas por los hongos en relación con ciertos factores, como por el ejemplo las condiciones de temperatura o el tipo de nutrientes. Entre los alimentos más relacionados con la contaminación con micotoxinas se encuentran los cereales, las nueces y el maní; ya que las esporas de hongos son muy abundantes en este tipo de productos, durante el almacenamiento y transporte de estos alimentos pueden crecer y producirse toxinas.  Los alimentos para animales se elaboran a base de muchos cereales y derivados de estos; por eso tiene importancia la determinación de éstas sustancias. Esto último con el fin de no afectar a los animales, en relación con lo que consumen, y a las personas que consumen productos de origen animal. Hay muchos tipos de micotoxinas, de cada tipo existe una gran cantidad de variantes.

1.2.1. Aflatoxinas

Las aflatoxinas son toxinas producidas por hongos Aspergillus flavus y A. parasiticus entre otros. Hay más de 20 tipos de aflatoxinas, las más importantes son B1, B2, G1, G2. La aflatoxina M1 es el metabolito tóxico de AFB1 que puede aparecer en la leche. Las aflatoxinas en la mayoría de animales produce un serio daño en el hígado, altera el sistema inmune (las defensas naturales contra infecciones), el crecimiento, la reproducción, disfunción gastrointestinal, disminución en la utilización del alimento, anemia e ictericia y disfunción en la producción (sea de leche, carne o huevos). Algunos de estos tipos son cancerígenos.

1.2.2. Ocratoxinas

Las Ocratoxinas son producidas por hongos del género Aspergillus spp como por el ejemplo el Penicillium spp. Dentro de la gran variedad de Ocratoxinas, es importante señalar la Ocratoxina A pues es muy nefrotóxica; esto es, que afecta a los riñones y en algunos casos la inmunidad de los animales. Entre los efectos que provoca en especies especificas se puede mencionar que en cerdos se reportan malformaciones en crías recién nacidas cuya madre tuvo contacto con la Ocratoxina A, en aves disminuye la producción de huevos; para el caso de los bovinos se reportan menos problemas pues esta toxina es metabolizada en rumen. Cabe mencionar que en el caso de los seres humanos esta toxina se encuentra relacionada con el desarrollo de algunos tipos de cáncer.

1.2.3. Deoxinivalenol

El Deoxinivalenol (DON) o Vomitoxina la producen hongos del género Fusarium spp . Los cerdos y las aves son los animales más susceptibles. En los cerdos se producen lesiones en el estómago y esófago, pérdida notoria de apetito, peso y daño renal. En las aves disminuye la ingesta de alimentos y producen lesiones en la mucosa oral. En bovinos también se metaboliza en rumen y la biodisponibilidad( la cantidad de toxina que llega a sangre y puede causar daño ) es baja.

1.2.4. Zearalenona

La zearalenona es un fitoestrógeno, producido también por hongos del género Fusarium sp. La especie más sensible es el cerdo en donde se observan muchos problemas reproductivos. En vacunos se asocia al síndrome hiperestrogénico, infertilidad, disminución de la concepción, disminución en la producción de leche y abortos.

1.2.5. Toxina T2

La toxina T2 se asocia en bovinos con lesiones gastrointestinales, inmunosupresión, síndromes hemorrágicos, diarrea hemorrágica y daño hepático; no existen niveles recomendados aún por la Unión europea. En aves de corral es muy importante su estudio, pues produce lesiones orales severas, disminuye la ingesta de alimento, disminuye el peso, disminuye la producción de huevos y empobrece la calidad de la cáscara, produce lesiones en las patas, dermatitis y puede incluso dañar la función de los ovarios.

1.2.6. Fumonisinas

Las Fumonisinas son un grupo de sustancias producidas por Fusarium moliniforme., F. proliferatum y otros. Existen varios tipos, el más frecuente es Fumonisina B. Pueden inhibir la síntesis de lípidos en membranas biológicas.(esfingolípidos). Se ha demostrado que causa cáncer en ratas y se ha relacionado con cáncer esofágico en humanos. En caballos produce leucoencefalomalacia equina cuyos síntomas son estupor, tambaleo, problemas de marcha como cojera, y finalmente un ataque y muerte. También afecta aves y cerdos.En rumiantes se ha observado afectación hepática

1.2.7. Unidades en las que se reportan micotoxinas

Se debe recordar que aún en concentraciones que se encuentren dentro de los rangos permitidos, dosis pequeñas de micotoxinas en consumo crónico pueden producir efectos a largo plazo. Además existe efectos sinérgicos (potenciador) entre diferentes micotoxinas, pudiéndose producir varias al mismo tiempo en los alimentos. La regulación sobre los valores permitidos de micotoxinas varían mucho dependiendo del país y del animal hacia el cuál va producido el alimento. Se incluye alguna información básica para que se pueda interpretar mejor los resultados de análisis . En la mayoría de los casos no existen valores unificados para los animales o la materia prima .

En la Tabla 1 se presenta una guía sobre los valores permitidos en alimento para animales en diferentes regiones del mundo. Esta guía no tiene validez legal y los valores no son absolutos. Si existen dudas sobre los valores consulte los reglamentos citados.

Unidades

ppb: partes por billón o µg/Kg (1/106)

ppm: partes por millón o mg/Kg (1/103)

Conversión

ppb ÷ 1000 = ppm

Ejemplo:

4 ppb Aflatoxina Total = 0.004 ppm

Los valores que se describen en la Tabla 1 se pueden encontrar los siguientes documentos. Los valores en el caso de la legislación son en alimentos con 12% de humedad. Se toma en cuenta también el porcentaje del alimento en la ración diaria. En Costa Rica no existen suficientes datos.

Directiva 2002/32/CE del Parlamento Europeo Sobre sustancias indeseables en la alimentación animal.

Directiva 2006/576/CE Recomendación de la Comisión sobre la presencia de Deoxinivalenol, zearalenona, , Ocratoxina A, Toxinas T2 yHT2, fumonisinas en productos destinados a la alimentación animal

Office of Indiana State Chemist : Courrent guidelines for mycotoxins. 2008. http://

 

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Tabla 1

Valores permitidos de micotoxinas en alimentos para animales

Ponedoras, vacuno y reproductor cerdas

MicotoxinaOrigen de alimentoAnimalValor máximo Permitido
   Costa RicaUnión EuropeaEstados Unidos (FDA)

Aflatoxina total

Productos de maíz

 

No determina valores para presencia total de aflatoxinas

100 ppb

Cerdos más de 100 lb

200 ppb

Ternero de engorde

300 ppb

OTROS

TODOS

20 ppb

20 ppb

Aflatoxina B1

Materias primas (excepto la siguientes)

 

 

50 ppb

No determina valores específicos para Aflatoxina B1

Maíz, maní, semilla de algodón

 

 

20 ppb

Alimento completo

Bovinos, ovinos y caprinos

 

50 ppb

Alimento completo

Lechero

 

5 ppb

Alimento completo

Terneros y cabritos

 

10 ppb

Alimentos complementarios (suplementos)

Bovinos, ovinos y caprinos

 

50 ppb

Alimentos complementarios

Cerdos y aves

 

30 ppb

Otros complementos

 

 

5 ppb

Deoxinivalenol (Vomitoxina)

Cereales y productos a base de cereales (menos maiz)

 

 

8 ppm

5 ppm

Subproductos de maiz

 

 

12 ppm

5 ppm

Alimentos completos y complementarios

 

 

5 ppm

5 ppp

Alimentos completos y complementarios

Cerdos

 

0.9 ppm

5

Alimentos completos y complementarios

Lechones

 

5

5

Alimentos completos y complementarios

Terneros< 4 meses, corderos, cabritos

 

2

10

Alimentos completos y complementarios

Rumiantes, terneros >4 meses, pollo

 

10

5

Ocratoxina A

Cereales y productos a base de cereales

 

 

0,25 ppm

 

Alimento completo y complementarios

Cerdos

 

0.05 ppm

 

Alimento completo y complementarios

Aves de corral

 

0,100 ppm

 

Zearalenona

Cereales y productos a base de cereales (menos maiz)

 

 

2 ppm

 

Subproductos de maiz

 

 

3 ppm

 

Alimentos completos y complementarios

Lechones y cerdas nulíparas

 

0.1

 

Alimentos completos y complementarios

Cerdos y cerdos de engorde

 

0,25

 

Alimentos completos y complementarios

Terneros, ganado lechero, ovejas y cabras (incluye coreros y cabritos)

 

0,5

 

Toxina T2 y HT2

No hay legislaciónn

 

 

 

 

 

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Tabla 2

Efectos de micotoxinas en algunas especies productivas

EspecieAves
(principalmente en pollos)
CerdosBovinos

Aflatoxinas

Anorexia.

Pérdida de la ganancia de peso.

Disminución en la producción de huevos.

Hemorragias en diferentes órganos.

Toxicidad para los embriones.

Interfiere con el metabolismo de la vitamina D , disminuyendo la fortaleza de los huesos y debilidad en las patas.(Síndrome del ave pálida) Incrementa la fragilidad de vasos capilares.

Inmunosupresora.

Reduce la ganancia de peso.

Interfiere con la síntesis de proteínas Digestión de lípidos.

Afecta la función renal, el hígado y la Inmunidad.

Puede exacerbar la deficiencia de vitaminas (A y E).

Afecta la producción de leche.

Disminuye la ingesta de alimento.

Afecta el sistema inmune. Hepatotóxica.

En algunos estudios, reduce la eficiencia reproductiva en ganado lechero.

Encefalopatías Edema

Ocratoxinas

En pollitos es hasta 3 veces más tóxica que la aflatoxina Es muy nefrotóxica Afecta la producción de huevos Disminuye la ingesta de alimento Disminuye la conversión alimenticia (muy importante) Dosis grandes debilitan la cáscara y aumentan la incidencia de huevos con manchas de sangre Retardada maduración sexual en pollitos que vienen de gallinas que han consumido Ocratoxinas Muy importante en pavos. Alta mortalidad. Muy inmunosupresora

Nefrotóxica, produce distintos grados de fallo renal. También tiene efecto importante en la inmunidad. Se han reportado malformaciones en cerditos y una disminución en la producción de semen. Se especula que puede producir malformaciones en lechones.

Muy pocos efectos en contaminaciones naturales Puede afectar edema en pulmón y riñón

DON

Efecto es principalmente sinérgico con la presencia de otras micotoxinas. Disminuye la ingesta de alimento y la producción de huevos

La toxicidad aguda produce náuseas y vómitos. En algunos estudios se reporta baja del peso y talla de los cerditos, lesiones en esófago y estómago, pérdida de apetito.

En Ganado Vacuno no se observan efectos en contaminaciones Naturales (Menos de 3% de biodisponibilidad)

T2

Necrosis e inflamación en la cavidad oral Dermatitis e irritación intestinal Inmunosupresor Afecta el bazo y el timo Disminuye la ingesta de alimento peso disminuye la producción de huevos y empobrece la calidad de la cáscara Daña la función de los ovarios Disminuye la fertilidad en gallosAumenta la mortalidad en gansos y pavos

Desórdenes reproductivos como atrofia en ovarios y útero Disfunción del endometrio Se han visto T2 toxicosis prenatal

Inmunosupresión Infertilidad Abortos Síndromes hemorrágicos Gastroenteritis y hemorragias gástricas Diarreas

Zearalenona

Son más resistentes a los efectos, aunque se ha relacionado en algunos estudios con malformaciones en pollitos cuando se encuentra con DON

Hembras mucho más sensibles. Les produce prolapso rectal y vaginal (vulvovaginitis), edema en útero, quistes ováricos. En machos hay degeneración del epitelio germinal. En conjunto disminuye la fertilidad. Aumenta en número de absorciones. Está asociada con malformaciones en los cerditos.

Puede dar síndrome hiperestrogénico Asociado con infertilidad y abortosEdema e hipertrofia de genitales en hembras pre puberales. Se asocia con una disminución de la LH y progesterona Síntomas: Vaginitis Secreciones vaginales Agrandamiento de las glándulas mamarias. Infertilidad y abortos.En algunos estudios puede disminuir hasta 25% de la tasa de concepción

Fumonisina

Principalmenta afecta pavos.Afecta las patas de las aves produciendo el síndrome tóxico alimentario como parálisis, extensión en el cuello y patas, marcha vacilante, jadeo y pobre crecimiento.(en dosis altas). Puede afectar la ingesta diaria

Edema pulmonar Porcino en intoxicaciones agudas. Se ha observado disfumciones cardiovasculares y efecto inmunosupresor

 

 

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